貴州實驗室裝修告(gao)訴(su)你實驗(yan)室如何檢(jian)測及解決PCR污染(ran)的方法(fa)

你的實驗結果受(shou)到污染(ran)的影響(xiang)了嗎？

生物(wu)實驗(yan)，大多數實驗(yan)檢(jian)測(ce)都(dou)是微觀的(de)，基于細胞，分子，蛋白水平，而這些微觀樣本(ben)(ben)對外界環境(jing)的(de)影響(xiang)敏感(gan)，比如溫度、ph值、酶解、損傷等，在我們(men)盡力呵護(hu)樣本(ben)(ben)的(de)生存(cun)環境(jing)的(de)同時(shi)，污染也(ye)是需要注(zhu)意(yi)的(de)頭等大事(shi)，要堅(jian)決避免環境(jing)中(zhong)的(de)“雜質”的(de)亂入，包括樣本(ben)(ben)污染，試劑儀(yi)器(qi)交叉污染、產物(wu)氣(qi)溶膠污染等對實驗(yan)結果(guo)的(de)影響(xiang)。“易(yi)(yi)查(cha)不易(yi)(yi)察”，污染來(lai)的(de)悄無(wu)聲息，防不勝防，假(jia)陽性結果(guo)讓無(wu)數生物(wu)學子抓狂和崩潰。

在(zai)(zai)眾多的(de)(de)生物實驗室(shi)，分子生物學(xue)檢測方法(fa)如(ru)PCR因其(qi)高靈敏度、快速、操作方便等(deng)優勢已經被廣泛(fan)應用，不(bu)過正(zheng)是由(you)于(yu)它(ta)靈敏度極(ji)高，極(ji)微量的(de)(de)污(wu)染(ran)源(yuan)都有(you)可能導致檢測結果(guo)的(de)(de)假陽(yang)性，所以對(dui)環境(jing)污(wu)染(ran)的(de)(de)控制也極(ji)為嚴格(ge)。面對(dui)眾多的(de)(de)污(wu)染(ran)源(yuan)，比如(ru)樣本(ben)交(jiao)(jiao)叉污(wu)染(ran)、試劑儀器交(jiao)(jiao)叉污(wu)染(ran)、克隆質(zhi)粒污(wu)染(ran)、PCR擴增產物污(wu)染(ran)、還有(you)極(ji)容易(yi)忽視的(de)(de)氣(qi)溶(rong)膠(jiao)污(wu)染(ran)，氣(qi)溶(rong)膠(jiao)是由(you)固(gu)體(ti)(ti)或液(ye)體(ti)(ti)小(xiao)質(zhi)點分散(san)并懸浮(fu)在(zai)(zai)氣(qi)體(ti)(ti)介(jie)質(zhi)中(zhong)形成(cheng)(cheng)的(de)(de)膠(jiao)體(ti)(ti)分散(san)體(ti)(ti)系(xi)，在(zai)(zai)空氣(qi)與液(ye)體(ti)(ti)面摩擦時，比如(ru)在(zai)(zai)操作時比較劇烈(lie)地(di)搖動反應管，開蓋(gai)時、吸樣時及污(wu)染(ran)進樣槍的(de)(de)反復(fu)吸樣都可形成(cheng)(cheng)氣(qi)溶(rong)膠(jiao)而(er)污(wu)染(ran)。據(ju)計算一個(ge)氣(qi)溶(rong)膠(jiao)顆粒可含48000拷貝，因而(er)由(you)其(qi)造成(cheng)(cheng)的(de)(de)污(wu)染(ran)是一個(ge)非(fei)常重(zhong)要而(er)被忽視的(de)(de)污(wu)染(ran)源(yuan)。

雖然這(zhe)(zhe)些(xie)(xie)污(wu)染(ran)(ran)(ran)對PCR實(shi)驗(yan)結果(guo)(guo)的(de)影響已經受到(dao)了廣泛重視(shi)，多(duo)數(shu)實(shi)驗(yan)室對污(wu)染(ran)(ran)(ran)控(kong)制都(dou)采取了各(ge)種辦法(fa)，比如定(ding)期大(da)(da)掃除清(qing)理(li)(li)、劃分操(cao)作(zuo)區(qu)域、試(shi)(shi)劑分裝、操(cao)作(zuo)謹(jin)慎、重復(fu)實(shi)驗(yan)、多(duo)角度(du)驗(yan)證(zheng)結果(guo)(guo)。但是(shi)微量的(de)核酸片(pian)段就(jiu)能被擴增(zeng)，所以對污(wu)染(ran)(ran)(ran)物(wu)的(de)控(kong)制不(bu)僅僅是(shi)做到(dao)這(zhe)(zhe)些(xie)(xie)就(jiu)能夠杜絕和避(bi)免的(de)，關鍵是(shi)需要從源(yuan)頭控(kong)制。目前多(duo)數(shu)生物(wu)試(shi)(shi)驗(yan)室，分子(zi)實(shi)驗(yan)每(mei)天都(dou)在大(da)(da)規(gui)模進行(xing)，污(wu)染(ran)(ran)(ran)源(yuan)已經無處不(bu)在，特(te)異性(xing)的(de)，非特(te)異性(xing)的(de)，同源(yuan)的(de)，非同源(yuan)的(de)，廣泛分布在樣本容器、實(shi)驗(yan)室臺面(mian)，試(shi)(shi)劑溶液中(zhong)、儀(yi)器表面(mian)內管附著等(deng)等(deng)，你以為(wei)普通的(de)清(qing)理(li)(li)就(jiu)能解(jie)決這(zhe)(zhe)些(xie)(xie)污(wu)染(ran)(ran)(ran)源(yuan)嗎？必須是(shi)不(bu)行(xing)的(de)，實(shi)驗(yan)室大(da)(da)拿們(men)都(dou)為(wei)了清(qing)除這(zhe)(zhe)些(xie)(xie)污(wu)染(ran)(ran)(ran)源(yuan)研究出好(hao)多(duo)種方(fang)法(fa)，整理(li)(li)跟(gen)大(da)(da)家共享。

01、合理的實驗室分區

實驗室內各工作區的實驗用品，包括移液器等應專用。如有可能，應在裝有紫外燈的層流式工作臺（如生物安全柜、超凈工作臺）內，吸加(jia)PCR試劑(ji)，工作臺(tai)內應放置PCR專業用的微量離心機、一次性(xing)手(shou)套、各量程的移液(ye)器和其他(ta)必須物品。

02、正確的實驗操作

吸(xi)加PCR試(shi)劑和模板的操作應嚴(yan)格按要(yao)求(qiu)進行，吸(xi)樣要(yao)慢，盡量(liang)一次(ci)性完(wan)成，忌多(duo)次(ci)抽吸(xi)，以免交(jiao)叉污染(ran)或(huo)產生氣溶膠污染(ran)。

實(shi)驗的過程中應(ying)勤換(huan)手套，貴州實(shi)驗室裝(zhuang)修在進出不同區域(yu)或進行模板操作后，都應(ying)及時(shi)更換(huan)手套。

裝有PCR試劑的(de)微量(liang)離心管(guan)(guan)在打開之前應先做瞬時(shi)離心（約10s），將(jiang)管(guan)(guan)壁(bi)及管(guan)(guan)蓋(gai)上的(de)液體(ti)甩至管(guan)(guan)底部，從而減少污染(ran)手(shou)套或加樣器的(de)機會(hui)。開管(guan)(guan)動作要(yao)輕，以防管(guan)(guan)內液體(ti)濺出或形成(cheng)氣(qi)溶膠，造(zao)成(cheng)污染(ran)。

在同時進(jin)行多個(ge)PCR反(fan)應時，應制備主反(fan)應混合液，再分(fen)裝至PCR反(fan)應管(guan)，最后添(tian)加樣品核(he)酸模板，以減少單(dan)個(ge)添(tian)加操作(zuo)繁(fan)瑣造成的污(wu)染(ran)。

03、實(shi)驗(yan)器具和試劑

實(shi)驗(yan)室自己配置的試劑(ji)，如去離子水(shui)、緩沖液等，在使用之前均應高壓滅菌(jun)或(huo)過濾除菌(jun)。

分(fen)裝PCR試(shi)劑：所有的PCR試(shi)劑都(dou)應小量(liang)分(fen)裝，以減(jian)少(shao)重(zhong)復取(qu)樣(yang)次數(shu)，并置于-20℃保(bao)存(cun)，適當時，最(zui)好(hao)做到專(zhuan)人(ren)專(zhuan)用。另外，PCR試(shi)劑、PCR反應液應與樣(yang)品及PCR產物分(fen)開保(bao)存(cun)，不應放于同一冰(bing)盒或冰(bing)箱。

所有吸頭(tou)、反應管等應一次性使(shi)用，使(shi)用之前(qian)，都應經(jing)過高壓處理。若條(tiao)件(jian)允許，最(zui)好使(shi)用帶濾器(qi)的(de)槍頭(tou)。各(ge)工作(zuo)區(qu)內的(de)移液器(qi)要有標識，應固(gu)定使(shi)用用途，不能交叉使(shi)用。

04、實驗設計

實驗(yan)設(she)計方面(mian)應遵循實驗(yan)室內部質量控制的相(xiang)關規定(ding)，實驗(yan)中至(zhi)少(shao)應：

貴(gui)州實(shi)(shi)(shi)驗(yan)室裝修設置(zhi)目(mu)標DNA陽(yang)性對照反應(ying)。對靶序列所作的(de)(de)適當的(de)(de)稀釋(shi)工作應(ying)于實(shi)(shi)(shi)驗(yan)前在實(shi)(shi)(shi)驗(yan)室內別的(de)(de)位(wei)置(zhi)進行，這(zhe)樣可防(fang)止將靶DNA的(de)(de)濃溶液帶到實(shi)(shi)(shi)驗(yan)室中專門進行PCR的(de)(de)位(wei)置(zhi)。

設置(zhi)PCR試(shi)劑陰(yin)性對(dui)(dui)照和目標DNA陰(yin)性對(dui)(dui)照反應。

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